Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.



Травма та її наслідки
Зала синя Зала жовта

Травма та її наслідки
Зала синя Зала жовта

Журнал «Травма» Том 13, №2, 2012

Вернуться к номеру

Дослідження поєднаної дії бісфосфонатів та вітаміну D3 за експериментального аліментарного остеопорозу

Авторы: Апуховська Л.І., Рясний В.М., Великий М.М. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України; Калашников О.В. - Інститут травматології та ортопедії АМН України; Великий О.М. - Національна дитяча спеціалізована лікарня «ОХМАТДИТ» МОЗ України, м. Київ

Рубрики: Травматология и ортопедия

Версия для печати


Резюме

Резюме. Дослідження проводили на експериментальній моделі аліментарного остеопорозу, що характеризується сповільненням росту кісток, порушенням структури компактної кісткової тканини і епіфізарного хряща, значним зниженням умісту 25ОНD3 в сироватці крові, а також гіпокальціємією та гіпофосфатемією. Доведено, що здатність різних бісфосфонатів нормалізувати мінеральний обмін та структурно-функціональний стан кісткової тканини за аліментарного остеопорозу визначається особливостями їх впливу на обмін вітаміну D3. Метиленбісфосфонової кислоти динатрієва сіль активує, а алендронат інгібує вітамін D3 25-гідроксилазну активність у гепатоцитах, що обумовлює суттєві відмінності у синтезі та забезпеченості організму 25ОНD3.

Резюме. Исследования проводили на экспериментальной модели алиментарного остеопороза, который характеризуется замедлением роста костей, нарушениями структуры компактной костной ткани и эпифизарного хряща, существенным снижением содержания 25ОНD3 в сыворотке крови, а также гипокальциемией и гипофосфатемией. Доказано, что способность разных бисфосфонатов нормализовать минеральный обмен и структурно-функциональное состояние костной ткани при алиментарном остеопорозе определяется особенностями их влияния на обмен витамина D3. Метиленбисфосфоновой кислоты динатриевая соль активирует, а алендронат ингибирует витамин D3 25-гидроксилазную активность в гепатоцитах, что обусловливает существенные отличия в синтезе и обеспеченности организма 25ОНD3.

Summary. The study was carried out on a experimental model of alimentary osteoporosis, which was characterized by bone growth impairment, disorders of the structure of compact bone tissue and epiphyseal cartilage. It was also observed the significant decrease in the level of 25OHD3 in serum as well as hypocalcaemia and hypophosphataemia. The ability of different bisphosphonates to normalize the mineral metabolism, structural and functional state of bone tissue for alimentary osteoporosis was shown to be associated with the peculiarities of their impact on the D3 vitamin metabolism. It was demonstrated that the methylenbisphosphonic acid disodium salt activated while alendronate inhibited the activity of D3 vitamin 25-hydrocsylase in hepatocytes, implicating significant differences in the synthesis of 25OHD3 and D3 vitamin availability.


Ключевые слова

Ключові слова: аліментарний остеопороз, бісфосфонати, вітамін D3, мінеральний обмін.

Ключевые слова: алиментарный остеопороз, бисфосфонаты, витамин D3, минеральный обмен.

Key words: alimentary osteoporosis, bisphosphonates, D3vitamin, mineral metabolism.

Вступ

Захворювання опорно-рухового апарату, як правило, супроводжуються остеопорозом, патологією, що посідає чільне місце в рейтингу основних медико-соціальних проблем сучасності. Поряд зі значною поширеністю в останні роки спостерігається стійка тенденція до прогресування порушень мінеральної щільності кісткової тканини у клінічно здорових молодих людей віком 18–25 років, тобто у період, коли завершується формування піка кісткової маси [1, 2]. В основі розвитку остеопорозу лежить інгібування процесу ремоделювання кісткової тканини внаслідок порушення регуляторних взаємозв’язків між остеокластами і остеобластами, що супроводжується зростанням активності остеокластів і зменшенням кількості й активності остеобластів. Інгібування процесу остеогенезу та підвищення процесу активності резорбції кісткової тканини обумовлює зменшення маси та щільності кісткової тканини, підвищення крихкості кісток та ризику їх переломів [3, 4]. Одним із важливих факторів, що сприяє розвитку остеопорозу, є дефіцит кальцію в організмі внаслідок недостатнього надходження або порушення обміну вітаміну D3, особливо у людей похилого віку, жінок постклімактеричного періоду, при довготривалому призначенні кортикостероїдів, при онкологічних захворюваннях кісткової тканини тощо [5, 6].

При лікуванні різних форм остеопорозу з метою пригнічення активності остеокластів широко використовують бісфосфонати — синтетичні аналоги природного неорганічного пірофосфату [7]. Завдяки високій спорідненості до мінеральних компонентів бісфосфонати ефективно зв’язуються з кальцій-фосфатами кристалів гідроксіапатитів, забезпечують високу локальну концентрацію у зоні резорбції кісткової тканини та гальмують процес демінералізації [8]. Пряма дія бісфосфонатів на клітини кісткової тканини полягає у тому, що вони інгібують метаболізм, функціональну активність та індукують апоптоз остеобластів, унаслідок чого гальмується кісткова резорбція. Одночасно бісфосфонати зменшують апоптоз остеобластів та остеоцитів [9, 10]. Механізм пригнічення активності остеокластів бісфосфонатами може полягати в утворенні нездатних до гідролізу АТР-аналогів, що інгібують АТР-залежні процеси та посилюють апоптоз остеокластів. Бісфосфонати, що містять нітрогенумісний бічний ланцюг, також посилюють апоптоз остеокластів, але через інгібування активності фарнезилпірофосфатсинтази, ключового регуляторного ензиму на шляху використання мевалонової кислоти в синтезі холестеролу, інших стеролів та ізопреноїдів. Зниження активності фарнезилпірофосфатсинтази веде до гальмування процесу пренілювання (фарнезилювання та геранілгеранілювання) — посттрансляційної модифікації протеїнів, включаючи невеликі GTP-зв’язувальні протеїни, такі як Rab, Rac, Rho, що відіграють центральну роль у регулюванні ключових процесів клітинної активності остеокластів, включаючи сигнальну трансдукцію, регуляцію їх проліферації, диференціації та апоптоз [11]. Позитивний ефект бісфосфонатів у лікуванні патологій кісткової тканини може проявлятись через активацію метаболічних перетворень вітаміну D3 — основного регулятора структурно-функціонального стану кісткової тканини.

Мета роботи — вивчити взаємодію вітаміну D3 та бісфосфонатів у регулюванні структурно-функціонального стану кісткової тканини та мінерального обміну за експериментального аліментарного остеопорозу.

 

Матеріали і методи досліджень

Дослідження проводили на щурах лінії Wistar масою 100 ± 5 г. Аліментарну модель остеопорозу викликали шляхом утримання щурів на D-гіповітамінозній дієті згідно з ГОСТом 11222-65 протягом 30 діб. Щурам із розвиненим аліментарним остеопорозом вводили внутрішньошлунково за допомогою зонду досліджувані препарати у вигляді водної суспензії об’ємом 0,1 мл протягом 10 діб. Контрольні тварини утримувались на повноцінному раціоні віварію.

Рівень кальцію, активність загальної лужної фосфатази та її ізоензимів у сироватці крові визначали за допомогою біотест-наборів («Лахема», Чехія); вміст неорганічного фосфору — після осадження протеїнів 12 % розчином ТХУ методом Dyce [12]; уміст 25OHD3, активного метаболіту вітаміну D3 — імуноферментним методом із використанням набору Vitamin D25-OH ELISE Kit виробництва фірми Immunodiagnostik (Германія). Вітамін D3 25-гідроксилазну активність у гепатоцитах визначали згідно з описаним вище і виражали в пмолях утвореного 25ОНD3 за 2 год інкубації на 106 гепатоцитів [13].

Остеометричні та гістологічні дослідження проводили на стегнових та великогомілкових кістках. Гістологічні зрізи кісткової тканини отримані в блоках целоїдину забарвлювали гематоксиліном, еозином та пікрофуксином за ван Гізоном [1]. Зольність кісткової тканини визначали методом сухої мінералізації при температурі 500–600 °С після її знежирення гексаном протягом 7 діб і розраховували щодо маси кісткової тканини. Вміст мінеральних компонентів у золі визначали вищеописаними методами.

Усі маніпуляції з тваринами проводили під легким ефірним наркозом та без порушень норм гуманного поводження з лабораторними тваринами, що не суперечить загальноприйнятим біоетичним нормам з дотриманням відповідних міжнародних положень стосовно проведення експериментальних робіт. Статистичну вірогідність результатів оцінювали в програмі SigmaPlot2000 з використанням t-критерію Стьюдента.

 

Результати та їх обговорення

Результати остеометричних, гістоморфологічних та біохімічних досліджень підтверджують розвиток аліментарної форми остеопорозу у щурів, яких утримували протягом 30 діб на вітамін D-дефіцитному раціоні. У піддослідних тварин знижується довжина та товщина дистального епіметафізу стегнової та великогомілкової кісток, відзначається зниження маси і зольності великогомілкової кістки, що супроводжується зниженням вмісту кальцію та фосфору в цій кістці (табл. 1).

Результати гістоморфологічних досліджень свідчать про гіпертрофію хрящових клітин, стоншення компактної кісткової тканини, порушення формування остеонів, вставних пластинок та внутрішніх оточуючих пластинок [1], що підтверджується даними гістометрії зони росту та структурної організації епіфізарного хряща стегнової та великогомілкової кісток (табл. 2).

Таким чином, за умов утримання дослідних тварин протягом 30 діб на D-гіповітамінозній дієті у них розвивається аліментарна форма остеопорозу, яка супроводжується порушенням росту кісток, структурно-функціонального стану кісткової тканини та епіфізарного хряща і проявляється порушенням формування остеонової структури та оточуючих кісткових пластинок, зупинкою вростання судин та процесом окостеніння і проліферації хрящових клітин.

Встановлення патогенезу розвитку остеопорозу обумовило цілеспрямоване застосування широкого кола лікарських препаратів у його терапії. До них належать бісфосфонати, вітамін D3, кальцій, селективні модулятори естрогенових рецепторів (інгібують резорбцію кісток), рекомбінантний паратиреоїдний гормон людини — анаболічний агент для кісток (стимулює утворення кісткової тканини шляхом зниження апоптозу остеобластів і тим самим підвищує кількість остеобластів та їх диференціацію), стронцію ранелат (гальмує резорбцію та посилює утворення кісток), тіболон — синтетичний стероїд, що має остеогенну, андрогенну та прогестагенну дію, тестостерон (посилює утворення кісток), деносумаб — моноклональні антитіла до ліганду активатора рецептора ядерного фактора kB (RANKL NF-kB), зв’язування яких викликає інгібування остеокластогенезу та, відповідно, зменшує резорбцію кісток [14].

Особливо ефективним підходом слід вважати поєднане застосування декількох із зазначених препаратів [15]. Тому в роботі було проведено дослідження сумісної дії бісфосфонатів різної структури, які з високою специфічністю зв’язуються з гідроксіапатитами кісткової тканини, та вітаміну D3 — основного регулятора структурно-функціональної активності кісткової тканини, що через вплив на експресію генів регулює формування кісткової тканини у процесі розвитку й ремоделювання протягом життєвого циклу. З цією метою щурам із аліментарним остеопорозом на тлі вітаміну D3 вводили різні форми бісфосфонатів — метиленбісфосфонової кислоти динатрієву сіль (МБФК) та алендронат.

Розвиток аліментарного остеопорозу у піддослідних щурів супроводжується чітко вираженими порушеннями мінерального обміну, що виявляється як гіпокальціємія та гіпофосфатемія. Вміст загального кальцію в сироватці крові знижується на 35,3 %, вміст фосфору неорганічного — на 30,5 % (табл. 3).

При введенні тваринам із остеопорозом вітаміну D3 рівень мінеральних компонентів у сироватці крові зростає, але є нижчим від показників контрольних тварин унаслідок короткого (10 днів) терміну призначення холекальциферолу. Спільне призначення бісфосфонату — МБФК з вітаміном D3 супроводжується вірогідним зростанням рівня кальцію й фосфору у сироватці крові порівняно з групою тварин, яким уводили лише вітамін D3. В той же час введення алендронату на тлі вітаміну D3 знижує його ефект щодо нормалізації вмісту мінеральних компонентів у сироватці крові. Більше того, вміст кальцію та фосфору у крові тварин цієї групи був нижчим, ніж у групі, яка отримувала МБФК на тлі введення холекальциферолу.

Результати виявлених змін мінерального обміну підтверджуються даними щодо впливу різних бісфосфонатів на активність лужної фосфатази — ензиму, що здійснює гідроліз органічних фосфатів та перенесення фосфат-аніонів на органічні компоненти перицелюлярного матриксу, тобто є біомаркером активності остеобластів. Із наведених у табл. 4 даних випливає, що за остеопорозу у сироватці крові значно зростає активність загальної лужної фосфатази (на 67,8 %), в основному за рахунок її кісткової ізоформи (на 68,4 %), яка за активністю значно (майже в 4 рази) перевищує кишкову ізоформу. Спільне введення вітаміну D3 із МБФК призводить до більш значного зниження активності лужної фосфатази, головним чином, за рахунок її кісткового ізоензиму, порівняно з уведенням лише холекальциферолу. В той же час введення алендронату на тлі вітаміну D3 супроводжується зниженням активності лужної фосфатази порівняно з групою, яка отримувала лише вітамін D3, але є вірогідно вищим порівняно з групою, якій вводили таку саму дозу МБФК. Виявлені зміни стосуються переважно кісткового ізоензиму. Зростання активності кишкової форми лужної фосфатази при остеопорозі може бути в основному пов’язаним із підвищеним виходом ізоензиму з ентероцитів унаслідок порушення структури їх мембран, оскільки за умов D-гіповітамінозу синтез цієї форми ензиму інгібується.

Виявлені порушення структурно-функціонального стану кісткової тканини, епіфізарного хряща та мінерального обміну за аліментарного остеопорозу обумовлені недостатнім надходженням в організм вітаміну D3. Найбільш використовуваним та вірогідним показником забезпеченості організму вітаміном D3 є вміст його гідроксильованої форми — 25-гідроксихолекальциферолу (25OHD3) у крові. Як свідчать результати, наведені у табл. 5, за умов остеопорозу вміст 25ОНD3 у сироватці крові знижується у 4 рази і становить 30,8 ± 1,5 нмоль/л–1, що згідно з сучасною характеристикою вітамінної забезпеченості класифікується як D3-вітамінний дефіцит. Одночасно вітамін D3 25-гідроксилазна активність у гепатоцитах зростає в три рази порівняно з їх активністю у контрольних тварин. За введення щурам із остеопорозом 40 МО вітаміну D3 протягом 10 діб уміст 25ОНD3 у сироватці крові підвищується на 183 %.

Вміст 25ОНD3 у сироватці крові та вітамін D3 25-гідроксилазна активність у гепатоцитах суттєво відрізняються за введення на тлі вітаміну D3 різних бісфосфонатів — МБФК або алендронату. Так, за спільного введення вітаміну D3 з МБФК уміст 25ОНD3 зростає (на 24 %) порівняно з групою, якій вводили тільки вітамін D3, а також посилюється вітамін D3 25-гідроксилазна активність у гепатоцитах практично до рівня контролю. Можна припустити, що МБФК знімає інгібуючий ефект 25ОНD3 на активність гідроксилюючих ензимів або активує їх синтез. Механізм такого позитивного ефекту на даний час не встановлений. На противагу цьому в групі, тваринам якої на тлі вітаміну D3 вводили алендронат, вітамін D3 25-гідроксилазна активність значно (в 3,2 раза) знижувалась порівняно з групою, що отримувала лише вітамін D3. Інгібування вітамін D3 25-гідроксилазної активності алендронатом супроводжується більш низьким рівнем забезпеченості організму 25ОНD3. На нашу думку, саме гальмування алендронатом вітамін D3 25-гідроксилаз у гепатоцитах може пояснювати низьку ефективність нітрогенумісних бісфосфонатів у поєднанні з вітаміном D3, що обумовило використання гормонально активної форми вітаміну D3 — 25(OH)2D3 у терапії остеопорозу бісфосфонатами з аналогічною структурою [3, 7, 8, 14]. Отже, встановлено, що МБФК є синергістом вітаміну D3 у регуляції структурно-функціонального стану кісткової тканини, та обґрунтована доцільність їх комплексного використання в терапії остеопорозу.

 

Висновки

  1. Доведено, що бісфосфонати з різною структурою (МБФК та алендронат) суттєво відрізняються за здатністю нормалізувати мінеральний обмін та структурно-функціональний стан кісткової тканини за аліментарного остеопорозу.
  2. 3щурам з аліментарним остеопорозом активує, а алендронат інгібує вітамін D3 25-гідроксилазну активність у гепатоцитах, що обумовлює суттєві відмінності у синтезі та забезпеченості організму гідроксильованою формою вітаміну D3 — 25ОНD3.
  3. Проведені дослідження обґрунтовують доцільність спільного використання препаратів вітаміну D3 та бісфосфонату — метиленбісфосфонової кислоти динатрієвої солі у лікуванні остеопорозу.

Список литературы

  1. Витамин D и костная система / Г.В. Гайко, Ан.В. Калашников, Л.И. Апуховская и др. — К.: Книга плюс, 2008. — 176 с.
  2. Воложина А.И. Остеопороз / А.И. Волжина, В.С. Оганова. — М.: Практическая медицина, 2005. — 238 с.
  3. Gass M. Preventing osteoporosis-related fractures: an overview / M. Gass, B. Dawson-Hughes // Am. J. Med. — 2006. — Vol. 119, № 4, Suppl 1. — Р. S3-S11.
  4. Поворознюк В.В. Менопауза и остеопороз / В.В. Поворознюк, Н.В. Григорьева. — К.: ВПЦ «Експрес», 2002. — 356 c.
  5. Holick M.F. MrOs Is D-ficient // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 2009. — Vol. 94, № 4. — P. 1092-1093.
  6. Summary of evidence-based review on vitamin D efficacy and safety in relation to bone health / A. Cranney, H.A. Weiler, S. O’Donnell et al. // Am. J. Clin. Nutr. — 2008. — Vol. 88, № 2. — P. 513S-519S.
  7. Fleurence R.L. The cost effectiveness of bisphosphonates for the prevention and treatment of osteoporosis: a structured review of the literature / R.L. Fleurence, C.P. Iglesias, J.M. Johnson // Pharmacoeconomics. — 2007. — Vol. 25, № 11. — P. 913-933.
  8. Bartl R. Bisphosphonates in Medical Practice (Actions-Side-Effects-Indications-Strategies) / R. Bartl, B. Frisch, von E. Trescow / — Berlin: Springer, 2007. — 265 p.
  9. Drake M.T. Bisphosphonates: Mechanism of Action and Role in Clinical Practice / M.T. Drake, B.L. Clarke, S. Khosla // Mayo Clin. Proc. — 2008. — Vol. 83, № 9. — P. 1032-1045.
  10. Russell R.G. Bisphosphonates: Mode of Action and Pharmacology // Pediatrics. — 2007. — Vol. 119, № S2. — P. S150-S162.
  11. The molecular mechanism of nitrogen-containing bisphosphonates as antiosteoporosis drugs / K.L. Kavanagh, K. Guo, J.E. Dunford et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2006. — Vol. 103, № 20. — P. 7829-7834.
  12. Dyce B.J. A rapid nonenzymatic assay for 2,3-DPG in multiple specimens of blood / B.J. Dyce, S.P. Bessman // Arch. Environmental Health. — 1973. — Vol. 27, № 2. — P. 112-115.
  13. АпуховськаЛ.І. Рольвітаміну Еврегуляції гідроксилювання холекальциферолуза D-гіповіта­мінозута D-гіпервітамінозу/ Л.І. Апуховська, М.М. Великий, А.В. Хоменко// Укр. біохім. журнал. — 2009. — Т. 81, № 5. — С. 50-57.
  14. Sandhu S.K., Hampson G. The pathogenesis, diagnosis, investigation and management of osteoporosis / S.K. Sandhu, G. Hampson // Journal of clinical pathology. — 2011. — Vol. 64, № 12. — P. 1042-1050.
  15. Ефективність біофармацевтичного препарату «Мебівід» у попередженні порушень обміну вітаміну D3 та кальцію за аліментарного остеопорозу / С.В. Комісаренко, Л.І. Апуховська, В.М. Ряснийта ін. // Біотехнологія. — 2011. — Т. 4, № 1. — С. 74-81.

Вернуться к номеру