Журнал «Медико-социальные проблемы семьи» 2 (том 18) 2013

Лейомиома матки является одним из самых распространенных заболеваний у женщин. Статистика свидетельствует, что частота встречаемости миомы матки составляет 12–25 % от всех гинекологических заболеваний и достигает максимальных значений в позднем репродуктивном и пременопаузальном возрасте [1, 2, 8]. В последние годы настораживает рост данной патологии среди женщин репродуктивного возраста. По данным Е.М. Вихляевой [1], миома матки чаще всего выявляется в возрасте 32–33 лет. У женщин моложе 20–30 лет миома матки встречается в 0,9–1,5 % случаев [1, 5, 6]. Среди клинических симптомов миомы матки ведущими являются нарушение менструального цикла с повышенной кровопотерей и, как следствие, анемией, привычное невынашивание беременности, бесплодие, снижение фертильности при вспомогательных репродуктивных технологиях [3, 5, 6, 13].

Несмотря на результаты многочисленных исследований, до сих пор не существует общепризнанного мнения в отношении патогенеза миомы матки. На современном этапе развития медицины в последние два десятилетия появились новые взгляды на развитие опухолевого процесса матки. Существовавшая ранее эндокринная теория объясняла рост и развитие опухолевого процесса матки наличием гиперэстрогении, как системной, так и в области узлов миомы [8]. Однако в настоящее время появились литературные сообщения о том, что прогестерон — ведущий гормон, который стимулирует рост миомы, а эстрогены являются гормонами-синергистами [9–11, 14].

Известно, что при развитии опухолевого процесса снижается интенсивность апоптоза, связанная с повышенной экспрессией белков семейства фактора некроза опухоли (Вах, Всl-2). Белку Вс1-2 как ингибитору этого процесса отводится ключевая роль в регуляции апоптоза, Вах определяет скорость процесса апоптоза [12, 15, 16].

Предполагается, что прогестерон в отличие от эстрогенов играет важную роль в экспрессии ингибитора апоптоза Вcl-2 в ткани миомы. Иммуногистохимические исследования выявили более высокое содержание Вс1-2 в лейомиоме по сравнению с окружающим миометрием [16, 17].

В то же время в исследовании in vitro обработка культуры клеток лейомиомы прогестероном вызывала стремительное увеличение экспрессии Bcl-2, а добавление эстрадиола привело к незначительному повышению экспрессии этого протоонкогена [11, 16, 18]. Исходя из этого, можно предположить, что прогестерон участвует в росте лейомиомы посредством индукции экспрессии Bcl-2, блокирующего апоптоз, и тем самым увеличивает интервал жизни клетки [17, 18].

Актуальным также остается вопрос об отличиях процессов апоптоза в пролиферирующем и простом типах лейомиомы матки.

Целью настоящего исследования явилось уточнение отдельных звеньев патогенеза лейомиомы матки путем сравнительного изучения рецепторного аппарата и факторов апоптоза миоматозных узлов в простом и пролиферирующем варианте опухоли, а также выявления взаимосвязи данных показателей.

Материалы и методы

Клиническое исследование проводилось на базе Донецкого регионального центра охраны материнства и детства. В течение 2010–2012 гг. проспективно было обследовано 150 небеременных женщин репродуктивного возраста с наличием лейомиомы матки больших размеров (диаметр доминантного миоматозного узла составлял 5 см и более). Всем женщинам, включенным в исследование, было проведено ультразвуковое исследование органов малого таза с использованием трехмерной энергетической допплерометрии внутриопухолевого кровотока. Было выявлено наличие двух типов кровоснабжения лейомиомы: диффузное расположение сосудов в узле, которое соответствовало пролиферирующему типу лейомиомы матки, и периферический ангиогенез, определявший простой тип опухоли. Данный показатель являлся признаком, по которому была проведена стратификация выборки на группы А1 и А2. Группа А1 включала 85 женщин с наличием диффузного внутриопухолевого кровотока и пролиферирующим гистологическим типом лейомиомы матки, группа А2 состояла из 65 пациенток с периферическим типом кровоснабжения лейоматозного узла и простым вариантом опухоли. Также была выделена контрольная группа (n = 40) — соматически и гинекологически здоровые небеременные женщины репродуктивного возраста.

После проведения клинико-лабораторных обследований и предоперационной подготовки всем женщинам с лейомиомой матки была проведена консервативная миомэктомия.

Наряду с оценкой данных анамнеза, жалоб, клинических показателей течения изучаемой патологии женщинам определяли содержание гонадотропного гормона пролактина, половых стероидных гормонов эстрадиола и прогестерона. Изучение концентрации гормонов производилось радиоиммунологическим методом с использованием стандартных наборов фирмы UBI MAGIWEL и Clone Systems (США) по инструкциям фирмы.

Ультразвуковое исследование у пациенток проводили на аппарате GE Voluson-730 Expert (США), оснащенном специализированными трехмерными датчиками: трансвагинальным RJC 5-9 и абдоминальным RAB 4-8L.

Изучение уровня экспрессии рецепторов к эстрогенам (РЭ) и прогестерону (РП) в удаленных миоматозных узлах проводили иммуногистохимическим методом с использованием тест-систем Рakocytomation En Vision (США), HRP (пероксидазы хрена) по инструкциям фирмы. Уровень экспрессии рецепторов определяли при помощи полуколичественного индекса: IRS = SI ґ PP, где IRS — индекс иммунореактивности, SI — оптическая интенсивность окрашивания, PP — процент позитивно окрашенных ядер.

Исследовали экспрессию факторов апоптоза (Bcl-2 и Bax) иммуногистохимическим методом с использованием мышиных моноклональных антител к Bcl-2 (клон 124, DAKO), Bax (клон 116, DAKO). Визуализацию первичных антител проводили с помощью системы детекции DAKO CSA II Biotin-free Tyramide Signal Amplication System. В качестве субстрата для пероксидазы хрена использовали DAB+ (DAKO). Интерпретацию результатов иммуногистохимического окрашивания с антителами к Вcl-2 и Вax производили с учетом того, что данный маркер имеет цитоплазматический характер окрашивания. Оптическая интенсивность окрашивания определялась субъективно и имела 4 градации: 0 — отсутствие окрашивания, 2 — слабое окрашивание, 4 — окрашивание средней интенсивности, 6 — интенсивное окрашивание. Процент положительно окрашенных клеток колебался от 0 до 100 %.

Все полученные результаты клинических наблюдений и лабораторных исследований были внесены в специально разработанную электронную базу данных. Статистическая обработка данных, математический анализ, построение графиков и диаграмм были выполнены на персональном компьютере Pentium IV, с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.2, фирмы StatSoft Inc. (США).

Нулевые гипотезы отвергались при достигнутом уровне значимости соответствующего статистического критерия р < 0,05. Стандартная обработка вариационных рядов включала подсчет медиан (Ме), квартильного размаха (25‰; 75‰), стандартного отклонения (SD). Сравнение эффективности лечения в двух независимых подгруппах осуществляли с помощью непараметрического U-критерия Манна — Уитни (Mann — Whitney, U-test). Сравнительный анализ двух зависимых выборок (до и после лечения) проводили с использованием критерия Вилкоксона (Wilcoxon watched pairs test); ранговый корреляционный анализ — с использованием критерия Спирмена R (Correlations Spearman).

Сравнение качественных переменных осуществляли путем анализа таблиц сопряженности с использованием точного критерия Фишера и, где было уместно, критерия Пирсона хи-квадрат с поправкой Йетса (2 x 2 Tables Xi/Vi/Phi, Fisher exact).

Результаты исследований и их обсуждение

При проведении первичного статистического анализа было выявлено, что возраст женщин с лейомиомой матки колебался от 18 до 45 лет, в среднем — 31,0 (28,0; 34,0) года. Установлено, что основной процент обследованных пациенток составляли жительницы городской зоны — 114/150 (76 %).

Жалобы на наличие тазовых болей и разнообразные нарушения менструального цикла превалировали в двух изучаемых группах. Ведущими симптомами были учащенное мочеиспускание, запоры, утомляемость, слабость, диспареуния. При этом болевой синдром чаще отмечался у пациенток с единичным миоматозным узлом, а выраженность дизурических расстройств напрямую зависела от размеров миомы и оказывала существенное влияние на семейные взаимоотношения и качество жизни пациенток. Чаще всего боли носили ноющий характер и не были связаны с менструальным циклом. Появление болевого синдрома скорее всего было связано с растяжением висцеральной брюшины, покрывающей матку, а также со сдавлением нервных окончаний в миометрии растущими узлами.

Среди перенесенных экстрагенитальных заболеваний преобладали заболевания лор-органов (хронический тонзиллит — 54 %), щитовидной железы (64 %), сердечно-сосудистой системы (29,33 %), молочных желез (36 %), желудочно-кишечного тракта (51 %), ожирение (39,33 %), анемия (33,33 %).

Выявлен высокий процент гинекологической патологии у женщин с лейомиомой матки: эрозия шейки матки (52,66 %), нарушения менструального цикла (43,33 %), воспалительные изменения придатков матки (40,66 %), бесплодие первичное (27,33 %), бесплодие вторичное (28,66 %).

Ультразвуковое исследование было проведено в динамике всем 150 пациенткам с лейомиомой матки. Оценивались такие показатели, как объем матки, локализация, количество и размеры лейоматозных узлов, их отношение к полости матки. Размеры матки у обследованных больных до операции составили: в группе А1 — 792,0 см³ (588,7; 1016,9 см³), в группе А2 — 685,4 см³ (519,0; 882,0 см³), в контрольной группе — 102,2 (87,9; 121,7 см³), p < 0,05.

В подгруппе А1 чаще встречались интерстициальная и субмукозная локализация узлов. При анализе полученных данных выявлено, что у 25,88 % пациенток группы А1 определялась атипичная локализация узлов, тогда как в группе А2 таких случаев не было (р < 0,0001). Характер роста узлов в обеих группах также был различен: у пациенток группы А1 в 2 раза чаще наблюдалось интерстициальное расположение узлов с преобладанием центрипетального роста, а субсерозная локализация опухоли выявлялась в 3,5 раза реже, чем в группе А2 (р < 0,0001). Субмукозное расположение миоматозных узлов было выявлено в обеих группах, но в группе А1 они встречались чаще, что подтверждено статистическими исследованиями. Более чем в половине случаев в обеих группах наблюдались пациентки с количеством узлов от 2 до 5, однако 10 и более узлов регистрировалось у пациенток с диффузным видом кровотока в миоматозных узлах.

Состояние гормонального статуса при лейомиоме матки у женщин репродуктивного возраста до проведения оперативного вмешательства представлено в табл. 1. Анализируя представленные данные, следует отметить, что показатель эстрадиола в группе пациенток с диффузным кровотоком статистически значимо превышал таковой в группе пациенток с периферическим кровотоком (р = 0,0021), но не отличался от аналогичного показателя в группе контроля (р = 0,0322).

Уровень прогестерона в группах А1 и А2 был идентичным, однако следует отметить, что данный показатель у пациенток группы А2 статистически значимо был меньше, чем у пациенток контрольной группы (р = 0,0062).

Исследование содержания пролактина в периферической крови показало, что в группе А1 он был выше, чем уровень содержания у пациенток группы А2 и контрольной, что подтверждено статистически (р = 0,0067, р = 0,0013).

Особый интерес представляют показатели функции щитовидной железы в исследуемых группах пациенток с лейомиомой матки и различным характером кровотока в миоматозных узлах. Согласно полученным данным, уровень тиреотропного гормона (ТТГ) в сыворотке крови у таких женщин превышал почти в 3 раза аналогичный показатель у пациенток контрольной группы. Между группами показатель тиреотропного гормона также был различен, что подтверждалось данными статистического анализа.

Уровень свободной фракции трийодтиронина (Т3) в сыворотке крови имел статистически значимые различия в сравниваемых группах женщин: в группе А1 концентрация данного гормона определялась меньшей величиной, чем в группе А2 (p < 0,0001), но большей, чем у пациенток контрольной группы (p = 0,0003).

Показатель свободной фракции тироксина у женщин с лейомиомой матки был статистически значимо ниже, чем в контрольной группе (р < 0,0001), а в группе А2 гормональная функция щитовидной железы была максимально снижена.

Показатели йодурии во всех исследуемых группах были следующими: в группе А1 выявлялся умеренный йододефицит, а в группе А2 — выраженный, что статистически значимо отличалось от контрольной группы (р < 0,0001).

Таким образом, проведенные исследования показали, что у значительного количества больных миомой матки развитие опухоли происходило на неизмененном гормональном фоне. Формирование миомы матки у обследованных пациенток происходило в условиях выраженного йододефицита, на фоне достоверного снижения гормональной функции щитовидной железы и повышения уровня пролактина.

После оперативного вмешательства у женщин групп А1 и А2 нами было проведено гистохимическое исследование факторов апоптоза и рецепторного аппарата удаленных миоматозных узлов.

В регуляции программированной клеточной смерти или апоптоза важную роль играет протоонкоген Bcl-2. Повышение экспрессии Bcl-2 в клетке изменяет нормальный ход апоптоза и тем самым увеличивает длительность жизни данной клетки. Таким образом, Bcl-2 играет важную роль в росте опухоли, выступая одним из регуляторов баланса между пролиферацией и гибелью клеток. Повышенная экспрессия Bcl-2 блокирует апоптоз, тем самым способствует увеличению интервала жизни клетки. После статистической обработки полученных данных было установлено, что экспрессия Bcl-2 в миоматозных узлах пациенток групп А1 и А2 была в 2 раза больше соответствующего показателя в контрольной группе (р < 0,0001) и не имела статистически значимых межгрупповых различий (р = 0,1628) (рис. 1А).

Гены Bcl-2 и Вах кодируют гомологичные белки, которые вызывают противоположное влияние на жизнедеятельность клетки. Если Bcl-2 способствует удлинению жизни клетки, то Вах действует в противоположном направлении — ускоряет апоптоз. В результате проведенного гистохимического исследования по определению Вах в миоматозных узлах пациенток групп А1 и А2 и в контроле (интактный миометрий) выявлено, что этот показатель был различным только в группе А1 и в контроле.

Соотношение показателей Bcl-2 и Вах характеризует выживаемость клеток. Предполагается, что соотношение белков Bcl-2 и Bax может быть главной детерминантой клеточной способности к апоптозу. Индекс выживаемости клеток (Bcl-2/Bax) у женщин с диффузным типом внутриопухолевого кровотока был статистически значимо выше аналогичного показателя в неизмененном миометрии и практически не отличался от такового значения в подгруппе А2, р = 0,6193 (рис. 1А).

Данные по рецепторному аппарату удаленных миоматозных узлов имели кардинальные межгрупповые различия. Так, экспрессия рецепторов к эстрогенам преобладала у женщин с диффузным типом кровотока в миоматозных узлах и была в 3 раза выше, чем в неизмененном миометрии (p < 0,0001), а также в 1,5 раза выше аналогичного показателя в группе А2 (p < 0,0001) (рис. 1Б).

Нами было отмечено значительное повышение экспрессии рецепторов к прогестерону в группе А1: в 8 и 4 раза выше аналогичных показателей в нормальном миометрии и в группе А2 соответственно, р < 0,0001 (рис. 1Б).

Проведенный анализ показал, что у пациенток группы А1 величина соотношения РП/РЭ практически в 2 раза выше, чем в группе А2 (p < 0,0001). Это свидетельствовало о преобладающем влиянии прогестерона на рост и структурные особенности миомы матки у пациенток с диффузным типом кровоснабжения и количественными показателями 3D-допплерографии, свидетельствующими о повышенной васкуляризации и пролиферации опухоли.

На следующем этапе нашего исследования мы попытались определить степень и направленность влияния половых стероидных гормонов на показатели апоптоза в миоматозных узлах. С помощью рангового корреляционного анализа с использованием критерия Спирмена R были изучены взаимосвязи между экспрессией рецепторов к прогестерону и показателями апоптоза в группах А1 и А2.

Установлено отсутствие корреляционных взаимосвязей показателя экспрессии РП, а также соотношения РП/РЭ с протоонкогеном Bax, определяющим скорость апоптоза.

Выявлено, что ингибитор апоптоза Bcl-2 у женщин группы А1 был прямо пропорционален концентрации РП в миоматозном узле (R = 0,52, р = 0,0003), а в группе А2 эта связь была меньшей силы, но также статистически значимой (R = 0,38, р = 0,0018) (рис. 2).

Показатель соотношения прогестероновых и эстрогеновых рецепторов в изучаемых группах А1 и А2 также статистически значимо коррелировал с уровнем Bcl-2: R = 0,43, р = 0,0007 и R = 0,4, р= 0,0017 соответственно (рис. 2).

Полученные данные указывали на прямое влияние прогестерона на скорость апоптоза в опухоли: с повышением уровня экспрессии РП увеличивалась концентрация ингибитора апоптоза Bcl-2, что приводило к удлинению жизни клеток миомы, способствуя ее росту.

При исследовании биологического действия эстрогенов на процессы апоптоза в лейоматозных узлах женщин групп А1 и А2 не было выявлено каких-либо статистически значимых корреляционных взаимосвязей между экспрессией рецепторов к эстрогенам и уровнем Bcl-2, Bax.

Следует отметить, что у пациенток контрольной группы мы не выявили каких-либо значимых корреляционных связей между показателями апоптоза и экспрессией РП и РЭ. Вероятно, это объясняется отсутствием аномальной экспрессии прогестероновых и эстрогеновых рецепторов в неизмененном миометрии и нормальным биологическим действием специфических стероидных гормонов. Корреляционные матрицы полученных результатов в подгруппах А1 и А2 и контрольной представлены в табл. 2.

Таким образом, доказано, что биологическое действие прогестерона относительно длительности жизни клеток миомы заключалось в увеличении их выживаемости путем повышения уровня Bcl-2, ингибирующего апоптоз, способствуя росту миоматозных узлов. Установлено, что эстрогены, связываясь со специфическими рецепторами, не влияли на процессы апоптоза в опухоли.

Выводы

Установлено, что формирование лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста происходит в условиях выраженного йододефицита, дисфункции щитовидной железы и повышения уровня пролактина.

Выявлено, что в лейомиоме с диффузным внутриопухолевым кровотоком соотношение прогестероновых рецепторов к эстрогеновым в 2,5 раза выше, чем в опухоли с периферическим кровотоком.

Доказано, что в миоматозных узлах с диффузным типом кровоснабжения индекс выживаемости клеток Bcl-2/Bax в 2 раза выше, чем в узлах с периферическим типом кровотока (р < 0,01).

Установлена положительная корреляционная взаимосвязь между показателем экспрессии рецепторов к прогестерону и индексом выживаемости клеток Bcl-2/Bax в миоматозных узлах (R = 0,49, р = 0,0004), что доказывает прямое влияние прогестерона на снижение процессов апоптоза в опухоли.

Итоги статистической обработки клинических и лабораторных данных, полученных в ходе исследования, а также результаты углубленного анализа взаимосвязей этих показателей позволили дополнить звено патогенеза развития лейомиомы матки у женщин репродуктивного возраста. Доказано, что прогестерон, связываясь со своими специфическими рецепторами, приводит к индукции экспрессии Bcl-2, блокирующего апоптоз, тем самым увеличивает интервал жизни клетки и способствует росту миоматозных узлов.